1. 凯氏半微量定氮法
凯氏氮是指凯氏定氮法,是由丹麦化学家凯道尔于1883年建立的,现已发展为常量、微量、平微量凯氏定氮法以及自动定氮仪法等,是分析有机化合物含氮量的常用方法。
凯氏定氮法的理论基础是蛋白质中的含氮量通常占其总质量的16%左右(12%~一19%),因此,通过测定物质中的含氮量便可估算出物质中的总蛋白质含量(假设测定物质中的氮全来自蛋白质),即: 蛋白质含量=含氮量/16%。
2. 半微量凯氏定氮法原理
凯氏定氮法是通过测出样品中的总含氮量再乘以相应的蛋白质系数而求出蛋白质的含量,此法的结果称为粗蛋白质含量。
原理:有机含氮化合物与浓硫酸共热消化,氮转化为氨,再与硫酸结合成硫酸铵。硫酸铵与强碱反应,放出氨。将氨蒸馏到过量的标准无机溶液中,再用标准碱溶液进行滴定。根据测得的氨量,计算样品的总氮量。、试剂与材料:浓硫酸、硫酸钾-硫酸铜粉末(称取80g硫酸钾和20g硫酸铜(五水),0.3g二氧化硒研细混合)、30%氢氧化钠溶液、2%硼酸溶液、0.01M标准盐酸、混合指示剂(田氏指示剂)储存液(取50ml0.1%甲烯蓝乙醇溶液与200ml0.1%甲基红溶液混合,储存于棕色瓶中备用。
克氏定氮法 :天然含氮有机化合物(如蛋白质)与浓硫酸共热时分解出氨,氨与硫酸反应生成硫酸铵。在克氏定氮仪中加入强碱碱化消化液,使硫酸铵分解出氨。用水蒸气蒸馏法将氨蒸入硼酸溶液中,然后再用标准稀硫酸酸溶液进行滴定,滴定所用稀硫酸酸的量(mol)相当于被测样品中氨的量(mol),根据所测得的氨量即可计算样品的含氮量。
原理是因为蛋白质含氮量通常在16%左右,所以将克氏定氮法测得的含氮量乘上系数6.25,便得到该样品的蛋白质含量。
3. 微量凯氏定氮实验装置
用标准的结晶牛血清清蛋白(BSA)或标准酪蛋白,配制成10mg/ml的标准蛋白溶液,可用BSA浓度1mg/ml的A280为0.66来校正其纯度。
如有需要,标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量,计算出其纯度,再根据其纯度,称量配制成标准蛋白质溶液。
4. 凯式微量定氮法
优点:
1、可用于所有食品的蛋白质分析中。
2、操作相对比较简单。
3、实验费用较低。
4、结果准确,是一种测定蛋白质的经典方法。
5、用微量凯氏定氮法可测定样品中微量的蛋白质。
缺点:
1、最终测定的是总有机氮,而不只是蛋白质氮。
2、实验时间太长,至少需要2小时才能完成。
3、精度差,精度低于双缩脲法。
二、凯氏定氮法注意事项
1、样品应是均匀的,固体样品应预先研细混匀,液体样品应振摇或搅拌均匀。
2、样品放入定氮瓶内时,不要沾附颈上,万一沾附可用少量水冲下,以免被检样消化不完全,结果偏低。
3、硝化时如不容易呈透明溶液,可将定氮瓶放冷后,慢慢加入百分之三十过氧化氢2到3毫升,促使氧化。
4、在整个消化过程中,不要用强火。保持和缓的沸腾,使火力集中在凯氏瓶底部,以免附在壁上的蛋白质在无硫酸存在的情况下,使氮有损失。
5. 用微量凯氏定氮法
在有催化剂的条件下,用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐,然后在碱性条件下将铵盐转化为氨,随水蒸气蒸馏出来并为过量的硼酸液吸收,再以标准盐酸滴定,就可计算出样品中的氮量。
由于蛋白质含氮量比较恒定,可由其氮量计算蛋白质含量,故此法是经典的蛋白质定量方法。
6. 半微量凯氏定氮仪
这是按样品的量来区分的:
常量分析:固体样品一克以上,液体和气体样品一毫升以上;
微量分析:固体样品一毫克以下,液体和气体样品一微升以下;
半微量分析:固体样品一毫克到一克,液体和气体样品一微升到一毫升;
7. 凯氏定氮法和微量凯氏定氮法
凯氏定氮法中的常量,微量,和半微量区别:
1.
最本质区别是样品用量不同
2.
使用装置不同
3.
样品结构不同
4.
效率不同
样品用量不同:区别在于检测用样品量,你可以按标准进行操作,没有必要拘泥于某一方法,主要看你样品量是否足够,不同的样品用量会产生不同的结果,其中常量定氮最多;
样品结构不同:常量由于可以把全部消化液一同蒸馏测定,故较适合蛋白质含量低的样品,而微量和半微量则可以用于蛋白质含量略高的样品
使用装置不同:微量、半微量差别在装置上,二者皆属于水蒸气蒸馏操作,只是前者把蒸汽直接导入反应室内,后者把蒸汽导入反应室外加热,由于二者皆取消化液的一部分操作,可平行蒸馏操作,但检测限要较常量法高。
效率不同:纯粹从回收率的角度看,半微量要稍好,但产品较少,常量的回收率要低一些,但产品会多一些。
凯氏定氮法是测量蛋白质含量的方法之一,也是最常用的,国内外普遍应用的方法
凯氏定氮法原理:蛋白质是含氮的有机化合物。食品与硫酸和催化剂一同加热消化,使蛋白质分解,分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。
然后碱化蒸馏使氨游离,用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定,根据酸的消耗量乘以换算系数,即为蛋白质含量。
8. 凯氏定氮法和半微量定氮法
水蒸气可使试样表面氨分压减小,充分带走氨。
凯氏定氮法是测定化合物或混合物中总氮量的一种方法。即在有催化剂的条件下,用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐,然后在碱性条件下将铵盐转化为氨,随水蒸气蒸馏出来并为过量的硼酸液吸收,再以标准盐酸滴定,就可计算出样品中的氮量。
所有试剂均用不含氨的蒸馏水配制。