1. 全内反射荧光显微镜应用
这两种显微镜可以看到细胞核
2. 荧光显微镜的特殊装置
原始的光学显微镜是一个高倍率的放大镜。
据记载,在1610年前意大利物理学家伽利略已制作过复式显微镜观察昆虫的复眼。这是一种已具目镜、物镜和镜筒等装置,并固定在支架上的显微镜。荷兰人 A·van·列文虎克一生制作了不少于247架显微镜,观察了许多细菌、原生动物和动、植物组织,是第一个用显微镜作科学观察的人。到18世纪显微镜已有许多改进,应用比较普遍,已作为一种商品进行生产。1872~1873年,德国物理学家和数学家E·阿贝提出了光学显微镜的完善理论,从此,镜头的制作可按预先的科学计算进行。
同时,德国化学家O·肖特成功地研制出供制作透镜的优质光学玻璃。他们和德国显微镜制作家卡尔·蔡司合作,建立了蔡司光学仪器厂,于1886年生产出具复消色差油镜的现代光学显微镜,达到了光学显微镜的分辨限度。从19世纪后期至20世纪60年代发展了许多类型的光学显微镜,如:偏光显微镜、暗视场显微镜、相差显微镜、干涉差显微镜、荧光显微镜。此外,还有许多特殊装置的显微镜,例如在细胞培养中特别有用的倒置显微镜。
20世纪80年代后期又发展了一种同焦扫描激光显微镜,结合图象处理,可以直接观察活细胞的立体图,是光学显微镜的一大进展。
3. 全内反射荧光显微镜原理
一、原理不同
1、荧光显微镜:是以紫外线为光源, 用以照射被检物体, 使之发出荧光, 然后在显微镜下观察物体的形状及其所在位置。
2、激光共聚焦显微镜:在荧光显微镜成象的基础上加装激光扫描装置,使用紫外光或可见光激发荧光探针。
二、特点不同
1、荧光显微镜:用于研究细胞内物质的吸收、运输、化学物质的分布及定位等。 细胞中有些物质,如叶绿素等,受紫外线照射后可发荧光;另有一些物质本身虽不能发荧光,但如果用荧光染料或荧光抗体染色后,经紫外线照射亦可发荧光。
2、激光共聚焦显微镜:利用计算机进行图象处理,从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图象,以及在亚细胞水平上观察诸如Ca2+、pH值、膜电位等生理信号及细胞形态的变化。
4. 荧光显微镜原理及应用
全内反射荧光显微镜(total internal reflection fluorescent microscope,TIRFM),利用光线全反射后在介质另一面产生衰逝波的特性,激发荧光分子以观察荧光标定样品的极薄区域,观测的动态范围通常在200nm以下。
因为激发光呈指数衰减的特性,只有极靠近全反射面的样本区域会产生荧光反射,大大降低了背景光噪声干扰观测标的,故此项技术广泛应用于细胞表面物质的动态观察。
5. 全内反射荧光显微技术
光学显微镜主要有双目体视显微镜、金相显微镜、紫外荧光显微镜、电视显微镜和电荷耦合器显微镜、扫描显微镜。分别的用途是:
1、双目体视显微镜在生物、医学领域广泛用于切片操作和显微外科手术;在工业中用于微小零件和集成电路的观测、装配、检查等工作。
2、金相显微镜专门用于观察金属和矿物等不透明物体金相组织。这些不透明物体无法在普通的透射光显微镜中观察,故金相和普通显微镜的主要差别在于前者以反射光,而后者以透射光照明。
3、紫外荧光显微镜用于生物和医学领域。某些标本在可见光中觉察不到结构细节,但经过染色处理,以紫外光照射时可因荧光作用而发射可见光,形成可见的图像。这类显微镜常用于生物学和医学中。
4、电视显微镜和电荷耦合器显微镜可以与计算机联用,这便于实现检测和信息处理的自动化,多应用于需要进行大量繁琐检测工作的场合。
5、扫描显微镜适用于高分辨率场合。在扫描显微镜中依靠缩小视场来保证物镜达到最高的分辨率,同时用光学或机械扫描的方法,使成像光束相对于物面在较大视场范围内进行扫描。这类显微镜适用于需要高分辨率的大视场图像的观测。粗准焦螺旋:大范围上下调动镜筒。 来源:-光学显微镜
6. 全内反射荧光显微镜应用场景
荧光显微镜的滤光片种类有以下几种: 1. 吸热滤光片 吸热滤光片是防止光源光谱中的热辐射线损伤光具组所必需的滤光片。 2.激发光滤光片 激发光滤光片可以选择性吸收长波谱线而吸通透紫外线,紫色,蓝色和绿色光线的滤光片为激发滤色片 。3.阻挡滤光片 阻挡滤光片是选择性吸收短波谱线和红外线而通透较长波长可视线的滤光片,其功能是使观察都能看到被检物体所激发出来的荧光,同时保护观察都的角膜免遭紫外线伤害。 4.色光分离滤光片 色光分离滤光片是将激发光反射到被检物体上,使被检物体激发出荧光,再将荧光透射到目镜的滤光反射镜。这类滤我片只能用于落射光聚光器中,而透射光荧光显微镜不需要色光分离。 5.干涉滤光片 干涉滤光片是高性能激发滤光片的一种。它是将数张薄层金属膜叠放在抛光的两张玻璃片之间制成的滤光片。每张薄金属膜的折光系数都不相同,因此照明光源的各种不同波长的谱线在每张金属膜上反复进行反射,使得某些波长的谱线因相消干涉而抵消,另一些波长的谱线相加干涉而得以加强,并透射过去,这样得到透射波谱很窄、半波峰宽度只有6-20nm,透光度可达到60% -70%的滤光片。
7. 反射式电子显微镜
光学显微镜分为低倍和高倍,电子显微镜不这样分,电子显微镜按结构和用途可分为透射式电子显微镜、扫描式电子显微镜、反射式电子显微镜和发射式电子显微镜等。分辨率上没有特定的“高倍低倍”之分。。
光学显微镜只能看到细胞和部分细胞器,如线粒体和叶绿体,但只能看到其存在,看不到细胞器的具体结构(如叶绿体的基粒、线粒体的脊就不能看到)
电子显微镜可以看到细胞器的精细结构,甚至可以看到病毒这种最小生物的结构,更甚至可以看到大分子,如蛋白质
8. 全内反射显微镜的工作原理
全反射棱镜 横截面是等腰直角三角形的棱镜叫全反射棱镜。图19-26中的等腰直角三角形ABC表示一个全反射棱镜的横截面,它的两个直角边AB和BC表示棱镜上两个互相垂直的侧面。如果光线垂直地射到AB面上,就会沿原来的方向射入棱镜,射到AC面上,由于入射角(45°)大于光从玻璃射入空气的临界角(42°),光会在AC面上发生全反射,沿着垂至于BC的方向从棱镜射出(如图19-26甲)。如果光垂直的射AC面上(如图19-26乙),沿原方向射入棱镜后,在AC、BC两个面上都会发生全反射,最后沿着入射时相反地方向入射时相反的方向从AC面上射出生活中很多地方都用到了这一原理,例如自行车尾灯(图19-27),就利用了这一原理 在光学仪器里常用全反射棱镜代替平面镜,改变光的传播方向。图19-28是全反射棱镜应用在潜望镜里的光路图。而在望远镜中为了获得较大的放大倍数,镜筒要很长,使用全反射棱镜,能够缩短镜筒的长度(图19-29)。 初看起来全反射棱镜仅仅相当于一个平面镜,使用全反射棱镜的地方完全可以用平面镜替代,但实际上却不是这样。一般的平面镜都是在玻璃的后表面镀银而成,平面镜的前表面即玻璃表面也反射光线,光线要经过玻璃表面和银面多次反射,所以会成多个像(图19-30)。其中第一次被银面反射所成的像(主像)最明亮,而其它的像则越来越暗,一般不会引起注意,但是对于精密的光学仪器,如照相机、望远镜、显微镜等,这些多余的像必须除去,所以常用全反射棱镜。当然,如果在玻璃前表面镀银,就不会产生多个像,但是前表面镀银,银面容易脱落。