1. 培养基模拟灌装批量
不需要做，培养基模拟灌装验证只针对不能最终灭菌的无菌药品。
培养基灌装作为培养基模拟灌装的模拟实验，可以直观、方便、准确地反映出培养基模拟灌装过程的污染情况及问题。培养基模拟灌装验证采用胰酪胨大豆肉汤培养基按无菌生产工艺模拟生产，过程中采用连续3次灌装的方式进行，再通过对培养基模拟灌装样品进行无菌检查，从而对无菌生产工艺中所有影响产品无菌结果的各个环节作出准确评价。因此,无菌产品生产工艺要做培养基模拟灌装实验。
2. 培养基模拟灌装最差条件
1、小量发酵种子液
2、灌装培养基
3、发酵罐中加入种子液发酵
4、检测OD、溶氧量等指标
5、流加培养基、搅拌
6、发酵到对数生长期中后，进行诱导
7、诱导表达一段时间，放罐 具体请参见《生物反应工程》《发酵工艺》
3. 培养基定量灌装机
2 仪器与用具
2.1 恒温培养箱,高压灭菌器应检定合格，且在使用有效期内。
2.2 培养基：胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA)，配制详见《培养基配制操作规程》（SOP-QC-0060）。
2.3 培养皿φ55mm。
2.4 一次性医用棉签、生理盐水、三角瓶、灭菌剪刀
3 测试条件
3.1 如使用自制培养基平板，在测定前培养皿表面必须严格消毒。
3.2 如使用市售预制平板，则每进入一级洁净区，即脱掉一层包装袋，测试所用培养皿最终以无菌状态进入所测定区域。
3.3 测定状态分为静态和动态，静态测试时室内测定人员一般不超过2人，测试人员必须穿戴符合环境洁净度级别的工作服。
3.4 对单向流测定应在净化空气调节系统正常运行时间不少于10min之后开始；对非单向流测定应在净化空气调节系统正常运行时间不少于30min之后开始。
4 表面微生物测试点选择及测试频度
4.1 采样点数目及其布置应根据以下几个方便设置：
空调系统初始验证的结果；房间（或区域）的大小和布局；房间（或区域）的用途；与暴露产品的距离；人流物流方向；设备、管理等的复杂程度；易受污染的部位等；
应考虑包含以下部位：每扇门、每个门把手、地板（至少两点）、墙壁（不易被清洁、消毒的部位，至少两点）、公共介质的管路（不易被清洁、消毒部位）、生产设备的关键性部位（如灌装针、易与人员接触的塑料帘膜、胶塞筒、传输带）等。
操作人员人体表面采样点应考虑以下部位:双手手指及掌内侧、双手前臂、前胸或腹、眼镜、前额、口罩等处。
根据洁净区内设施、设备等表面对产品和洁净室环境的影响程度，通常将表面分为三类：关键表面（产品、容器及密封件的表面）、一般表面（如设备的外表面、墙壁等）和地面，并且分别设定不同的微生物限度要求。
4.2 采样次数
一般来说，对于同一洁净区或区域，每个相同的取样物体应在其不同的地方采2个样。如墙面2个采样点，地面2个采样点，洁净区主要设备2个采样点等。
表面微生物的每点采样点面积宜控制在25cm2左右。
4.3 测试频度
洁净区表面微生物测试的频率见表1。
表1 测试频率
4.4 日常监测采样点和频度见 洁净室（区）环境监测管理规程（SOP-QC-0095 01）。
5 测试方法
5.1 接触平皿法
5.1.1 接触平皿法适用于平整表面。
5.1.2采样前仔细检查每个培养皿的质量，如发现变质、破损或污染的应剔除。
5.1.3 在培养皿上盖标记测定项目、测定点，日期等信息。
5.1.4 表面附着菌
5.1.4.1 打开接触板碟盖，让培养基表面与取样面直接接触，均匀按压接触板底板，确保培养基表面与取样点表面充分接触不少于10秒，再盖上碟盖。
5.1.4.2 取样后，立即用75%乙醇擦拭取样表面。
5.1.5 手套附着菌
5.1.5.1 打开接触板碟盖，操作者并拢五指，将双手指面与培养基表面均匀充分接触不少于10秒，再盖上碟盖。
5.1.6 取样后的接触板置于培养箱中，先30～35℃培养不少于3天，再20~25℃培养不少于2天。
5.2 棉签擦拭法
5.2.1 棉签擦拭法适用于非平整表面。
5.2.2 取100ml生理盐水放入250ml三角瓶中作为浸出液，取300ml生理盐水放入500ml三角瓶中作为洗净液，取400ml生理盐水放入500ml三角瓶中作为空白液，121℃15分钟灭菌。
5.2.3 在三角瓶上标记测定点、日期等信息。
5.2.4 取出一次性棉签，握住棉签柄，用浸出液浸湿棉头，以约30度角与取样表面接触，擦拭面积为5cm×5cm，缓慢纵横交互擦拭3遍。
5.2.5 擦拭完毕，用已灭菌剪刀剪断棉签，棉头装入100ml浸出液的三角瓶内，手持一端废弃。
5.2.6 取样后，立即用75%乙醇擦拭取样表面。
5.2.7 将上述取样后的三角瓶振摇2分钟，每分钟振摇120次，在超净工作台内通过过滤装置，将100ml浸出液全部过滤。浸出液过滤完毕，用洗净液300ml分三次冲洗过滤器，将过滤后的滤膜放入培养基平板内。用400ml空白液进行过滤，做为空白。
5.2.8 将样品培养基平板和空白样培养基平板倒置在培养箱中，先30~35℃培养不少于3天，再20~25℃培养不少于2天。
4. 培养基模拟灌装数量和批量
酵母菌的培养和观察 实验前的思考 人类认识和利用酵母菌的历史悠久，早在史前时期，先人们就学会酿酒。约在6000年前，就发明发面的方法。直到十九世纪有了显微镜，人们才窥探到醉母菌的真面目。对酵母菌做纯系培养分类研究的是与巴斯德同时代的丹麦人汉斯，他是为寻求酿造高品质啤酒的途径才去深入研究酵母菌 目的要求 认识酵母菌的形态结构和出芽生殖。 酵母菌的利用。 材料用具 酵母菌培养液，显微镜，解剖针，载玻片，盖玻片，吸管，镊子，稀释的碘酒，吸水纸（或白纸），放大镜，纱布。 方法步骤 一 酵母菌的利用 1查阅酵母菌的利用相关资料：属真菌。体呈圆形、卵形或椭圆形，内有细胞核、液泡和颗粒体物质。通常以出芽繁殖；有的能进行二等分分裂；有的种类能产生子囊孢子。广泛分布于自然界... 酵母菌的培养和观察 实验前的思考 人类认识和利用酵母菌的历史悠久，早在史前时期，先人们就学会酿酒。约在6000年前，就发明发面的方法。直到十九世纪有了显微镜，人们才窥探到醉母菌的真面目。对酵母菌做纯系培养分类研究的是与巴斯德同时代的丹麦人汉斯，他是为寻求酿造高品质啤酒的途径才去深入研究酵母菌 目的要求 认识酵母菌的形态结构和出芽生殖。 酵母菌的利用。 材料用具 酵母菌培养液，显微镜，解剖针，载玻片，盖玻片，吸管，镊子，稀释的碘酒，吸水纸（或白纸），放大镜，纱布。 方法步骤 一 酵母菌的利用 1查阅酵母菌的利用相关资料：属真菌。体呈圆形、卵形或椭圆形，内有细胞核、液泡和颗粒体物质。通常以出芽繁殖；有的能进行二等分分裂；有的种类能产生子囊孢子。广泛分布于自然界，尤其在葡萄及其他各种果品和蔬菜上更多。是重要的发酵素，能分解碳水化合物产生酒精和二氧化碳等。生产上常用的有面包酵母、饲料酵母、酒精酵母和葡萄酒酵母等。有些能合成纤维素供医药使用，也有用于石油发酵的。啤酒酵母属酵母菌属。细胞呈圆形、卵形或椭圆形。以出芽繁殖，能形成子囊孢子。在发酵工业上，可用来发酵生产酒精或药用酵母，也可通过菌体的综合利用提取凝血质、麦角固醇、卵磷脂、辅酶甲与细胞色素丙等产品。 2联系实际，参观沙湾啤酒厂，获得酵母菌，麦芽，带回准备试验 二、观察酵母菌 1．取一滴酵母菌培养液，制成临时装片。用显微镜观察酵母菌的形态和颜色。 2．用稀释的碘酒染色，观察酵母菌的细胞壁、细胞核、细胞质和液泡。 3．画一个正在进行出芽生殖的酵母菌，注出芽体。 三 酵母菌的扩培 3 菌种和培养基 3.1 菌种：啤酒酵母 3.2 培养基 3.2.1 酵母斜面培养基 10°麦芽汁固体斜面，pH5.0 3.2.2 酵母摇瓶种子培养基 10°麦芽汁，pH5.0或葡萄糖10%，玉米浆1%，尿素O.2%，pH5.0。 3.2.3 酵母分批发酵培养基 玉米粉经液化、糖化，折合葡萄糖浓度为10%，玉米浆1%，硫酸铵0.4%，pH5.5。 3.2.4酵母分批补料发酵培养基(学生讨论提出) 4 实验仪器、设备 （1）5升发酵罐； （2）摇瓶机或手摇； （3）超净工作台； （4）离心机 （5）显微镜 （6）分光光度计 （7）三角瓶。 5 实验过程 5.1 分批培养 5.1.1 总流程 斜面培养 斜面培养基配制与灭菌，接种，培养 ↓ 所需仪器物品：灭菌锅，试管，棉塞，培养基原料，培养箱 摇瓶种子 300毫升种子液，500ml三角瓶三只。装液100ml，培养基，培养摇瓶，纱布。 ↓ 上罐培养 (双酶制糖)糖化液稀释至l0%浓度，添加辅料，灭菌，接种。 ↓ 菌体分离 离心机或板框过滤器 5.1.2 斜面种子制备 自保藏斜面中挑取一环酵母菌体接入新鲜的斜面试管中，于28℃培养箱中培养24h。 5.1.3 摇瓶种子的制备 将上述培养好的斜面种子接入500ml三角瓶装的灭过菌的100ml摇瓶种子培养基中，在28℃，200rpm震荡培养15-20h。 5.1.4 发酵罐培养 5升发酵罐装入2升发酵培养基，121℃灭菌20min，冷却至30℃，将培养好的摇瓶种子接入发酵罐（接种量2~3%）进行发酵。发酵条件为：温度28℃， 5.1.5 过程监控 0小时：取样测定总糖和还原糖； 4~24小时：每隔4小时取样镜检、、菌体浓度； 6 实验时间 三天 7 实验分析项目和方法 （1）酵母镜检； （2）酵母浓度测定(湿重法)：吸取5ml菌液，2500rpm离心5min，去上清液，称量菌体湿重 （3）发酵活力的测定 8 实验报告内容和数据处理 9 实验结果和讨论 。 补充：5升发酵罐可用玻璃器皿代替，
5. 培养基模拟灌装培养温度
商业化即用型培养基是:
目前即用型瓶装培养基在国内外还没有同类产品生产，该产品以其质量稳定、操作简便、快速高效的特点，将逐渐成为疾病控制中心、大型制药企业、药检所和商检机构等优先选择的产品。它替代了由实验室采购干粉培养基配制成培养基使用的传统方法。而是由专业的培养基生产厂家直接灌装成一次性的塑料瓶装产品，经辐照灭菌，进行市场销售，保质期达一年以上，质量稳定，使用方便。
6. 培养基模拟灌装批量要求
酵母菌的培养和观察 实验前的思考 人类认识和利用酵母菌的历史悠久，早在史前时期，先人们就学会酿酒。约在6000年前，就发明发面的方法。直到十九世纪有了显微镜，人们才窥探到醉母菌的真面目。对酵母菌做纯系培养分类研究的是与巴斯德同时代的丹麦人汉斯，他是为寻求酿造高品质啤酒的途径才去深入研究酵母菌 目的要求 认识酵母菌的形态结构和出芽生殖。 酵母菌的利用。 材料用具 酵母菌培养液，显微镜，解剖针，载玻片，盖玻片，吸管，镊子，稀释的碘酒，吸水纸（或白纸），放大镜，纱布。
方法步骤 一 酵母菌的利用 1查阅酵母菌的利用相关资料：属真菌。体呈圆形、卵形或椭圆形，内有细胞核、液泡和颗粒体物质。通常以出芽繁殖；有的能进行二等分分裂；有的种类能产生子囊孢子。广泛分布于自然界... 酵母菌的培养和观察 实验前的思考 人类认识和利用酵母菌的历史悠久，早在史前时期，先人们就学会酿酒。约在6000年前，就发明发面的方法。直到十九世纪有了显微镜，人们才窥探到醉母菌的真面目。
对酵母菌做纯系培养分类研究的是与巴斯德同时代的丹麦人汉斯，他是为寻求酿造高品质啤酒的途径才去深入研究酵母菌 目的要求 认识酵母菌的形态结构和出芽生殖。 酵母菌的利用。
材料用具 酵母菌培养液，显微镜，解剖针，载玻片，盖玻片，吸管，镊子，稀释的碘酒，吸水纸（或白纸），放大镜，纱布。
方法步骤 一 酵母菌的利用 1查阅酵母菌的利用相关资料：属真菌。体呈圆形、卵形或椭圆形，内有细胞核、液泡和颗粒体物质。通常以出芽繁殖；有的能进行二等分分裂；有的种类能产生子囊孢子。广泛分布于自然界，尤其在葡萄及其他各种果品和蔬菜上更多。是重要的发酵素，能分解碳水化合物产生酒精和二氧化碳等。生产上常用的有面包酵母、饲料酵母、酒精酵母和葡萄酒酵母等。有些能合成纤维素供医药使用，也有用于石油发酵的。啤酒酵母属酵母菌属。细胞呈圆形、卵形或椭圆形。以出芽繁殖，能形成子囊孢子。在发酵工业上，可用来发酵生产酒精或药用酵母，也可通过菌体的综合利用提取凝血质、麦角固醇、卵磷脂、辅酶甲与细胞色素丙等产品。 2联系实际，参观沙湾啤酒厂，获得酵母菌，麦芽，带回准备试验 二、观察酵母菌 1．取一滴酵母菌培养液，制成临时装片。用显微镜观察酵母菌的形态和颜色。
2．用稀释的碘酒染色，观察酵母菌的细胞壁、细胞核、细胞质和液泡。
3．画一个正在进行出芽生殖的酵母菌，注出芽体。 三 酵母菌的扩培 3 菌种和培养基 3.1 菌种：啤酒酵母 3.2 培养基 3.2.1 酵母斜面培养基 10°麦芽汁固体斜面，pH5.0 3.2.2 酵母摇瓶种子培养基 10°麦芽汁，pH5.0或葡萄糖10%，玉米浆1%，尿素O.2%，pH5.0。 3.2.3 酵母分批发酵培养基 玉米粉经液化、糖化，折合葡萄糖浓度为10%，玉米浆1%，硫酸铵0.4%，pH5.5。 3.2.4酵母分批补料发酵培养基(学生讨论提出) 4 实验仪器、设备 （1）5升发酵罐；
（2）摇瓶机或手摇；
（3）超净工作台；
（4）离心机 （5）显微镜 （6）分光光度计 （7）三角瓶。 5 实验过程 5.1 分批培养 5.1.1 总流程 斜面培养 斜面培养基配制与灭菌，接种，培养 ↓ 所需仪器物品：灭菌锅，试管，棉塞，培养基原料，培养箱 摇瓶种子 300毫升种子液，500ml三角瓶三只。装液100ml，培养基，培养摇瓶，纱布。 ↓ 上罐培养 (双酶制糖)糖化液稀释至l0%浓度，添加辅料，灭菌，接种。 ↓ 菌体分离 离心机或板框过滤器 5.1.2 斜面种子制备 自保藏斜面中挑取一环酵母菌体接入新鲜的斜面试管中，于28℃培养箱中培养24h。 5.1.3 摇瓶种子的制备 将上述培养好的斜面种子接入500ml三角瓶装的灭过菌的100ml摇瓶种子培养基中，在28℃，200rpm震荡培养15-20h。 5.1.4 发酵罐培养 5升发酵罐装入2升发酵培养基，121℃灭菌20min，冷却至30℃，将培养好的摇瓶种子接入发酵罐（接种量2~3%）进行发酵。发酵条件为：温度28℃， 5.1.5 过程监控 0小时：取样测定总糖和还原糖； 4~24小时：每隔4小时取样镜检、、菌体浓度； 6 实验时间 三天 7 实验分析项目和方法 （1）酵母镜检； （2）酵母浓度测定(湿重法)：吸取5ml菌液，2500rpm离心5min，去上清液，称量菌体湿重 （3）发酵活力的测定 8 实验报告内容和数据处理 9 实验结果和讨论 。 补充：5升发酵罐可用玻璃器皿代替，