超微量紫外分光光度计方法(超微量分光光度计检测)

海潮机械 2023-01-04 13:30 编辑:admin 128阅读

1. 超微量分光光度计检测

当一束已知强度的单色入射光(I0) 通过溶液时,一部分光被溶液吸收(吸光强度Ia),另一部分则透过溶液(透光度强It)。吸光率等于透光率的负对数(A=-lgT)

一、原理不同

1、吸光光度法:吸光光度法是借助分光光度计测定溶液的吸光度,根据朗伯一比耳定律确定物质溶液的浓度。吸光光度法是比较有色溶液对某一波长光的吸收情况。

2、分光光度法:分光光度法是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度,对该物质进行定性和定量分析的方法。

二、特点不同

1、吸光光度法:灵敏度高,准确度较高,简便、快速,应用广泛。

2、分光光度法:具有灵敏度高、操作简便、快速等优点,是生物化学实验中最常用的实验方法。

三、用途不同

1、吸光光度法:适用于微量组分的分析。

2、分光光度法:物质进行定性和定量的分析。

2. 超微量分光光度计检测所提取DNA浓度

将待测DNA溶液作适当稀释,选用光程为0.5cm的石英比色杯,在紫外分光光度计上测定OD260和OD280的值,按以下公式计算DNA浓度。

1000ng/1000ul =1ug/ml

据朗波-比尔光吸收定律A=-lgT=εbc知,c=A/εb,而b通常为1cm,所以,通常以1OD值相当于50μg/mL双螺旋DNA,或40μg/mL单螺旋DNA(或RNA),或20μg/mL寡核苷酸计算。

3. 超微量分光光度计检测DNA

光束紫外可见分光光度计是最近两年在市场中流行多的设备,对于这种设备可能有些朋友们对此了解不全面,那么对于这种新型设备而言存有哪些优势特点呢?如果大家想要知道就请认真阅读下文。

   双光束紫外可见分光光度计优势特点

   优势特点一:使用该设备能够有效减少光源能量的漂移影响,这点可能大家很好进行理解的,在使用普通紫外可见分光光度计进行测量时候,当发生光源能量漂移情况后就会直接影响到测量的准确性,而使用双光束紫外可见分光光度计设备就能避免这种情况的发生。

   优势特点二:使用这种设备能够减少温度变化而引起的溶液密度与折光率改变的情况影响,普通紫外可见分光光度计在对样品检测时候,会随着样品溶液密度和折光率的不同造成测量偏差的出现,而使用这种新型的设备就能避免这种情况发生了。

   双光束紫外可见分光光度计实际用途

   用途一:这种设备可以有效使用在相关药物分析用途中。在双光束紫外可见分光光度计设备中独有相关药物检测系统,再加上在国家药典中很多药品都是可以使用紫外可见分光光度计进行检测,在整个使用中不仅仅有使用简单方便优势,而且还能有效提高相关工作效率。

   用途二:可以直接使用在生命科学用途中。双光束紫外可见分光光度计能对生命领域的微量样品进行测试不说,还能有效提供DNA蛋白质的检测可以快速检测出蛋白质的浓度,甚至还能使用设备设置不同分析方法进而满足相关一些不同需要。

   用途三:可以直接使用在农业用途中。双光束紫外可见分光光度计在农业领域中可以对农业中的农药残留进行检测不说,也能对作物成分、兽药、饲料、化肥、土壤成分和水产养殖进行检测。

4. 超微量分光光度计检测DNA的最低体积量是

OD值是光密度的缩写,也可以称为吸光度。吸光度指的是利用物质特有的吸收光谱,来鉴别物质或者测定物质的含量,也就是将一束特定波长的光通过被检测物,被检测物可以将光吸收掉一部分,通过吸光度计算被检测物的浓度。

一般被检测物浓度越高,吸光度的值就会越高。临床使用这种分光光度法来检测很多物质,比如可以检测乙肝表面抗原这种蛋白质。

另外一些DNA、RNA的检测也可以用分光光度法检测,还有电解质以及血液中毒时候的中毒物质检测,包括血清百草枯的检测都可以使用OD值表示。

5. 超微量分光光度计检测RNA

【目的要求】:

了解:分光光度法测定DNA浓度和纯度的原理;

掌握:分光光度法测定DNA浓度和纯度的技术方法;

熟悉:分光光度法测定DNA浓度和纯度的实验操作步骤和注意事项。【实验原理】:

前面提取得到的DNA的浓度和纯度都是未知的,在后续的DNA酶切、连接及转化等实验中需要一定的浓度和纯度要求,因此要测定DNA的浓度和纯度。

测定DNA的方法通常有:紫外分光光度法;琼脂糖凝胶电泳法(也叫荧光光度法)

(1)紫外分光光度法:

组成DNA的碱基均具有一定的吸收紫外线特性,最大吸收值在波长为250~270nm之间,腺嘌呤的最大紫外线吸收值在260.5nm,胞嘧啶:267nm,鸟嘌呤:276nm,胸腺嘧啶:264.5nm,尿嘧啶:259nm。这些碱基与戊糖、磷酸形成核苷酸后其最大吸收峰不会改变,但核酸的最大吸收波长是260nm,吸收低谷在230nm。这个物理特性为测定核酸溶液浓度提供了基础。在波长260nm紫外线下,10OD值的光密度相当于双链DNA浓度为50μg/ml;单链DNA或RNA为40μg/ml;单链寡聚核苷酸为20μg/ml。可以此来计算核酸样品的浓度。

分光光度法不但能够确定核酸的浓度,还可以通过测定在260nm和280nm的紫外线吸收值的比值(A260/A280)估计核酸的纯度。DNA的比值为1.8,RNA的比值为2.0。若DNA比值高于1.8,说明制剂中RNA尚未除尽。RNA、DNA溶液中含有酚和蛋白质将导致比值降低。270nm存在高吸收表明有酚的干扰。当然也会出现既含蛋白质又含RNA的DNA溶液比值为1.8的情况,所以有必要结合凝胶电泳等方法鉴定有无RNA,或用测定蛋白质的方法检测是否存在蛋白质。紫外分光光度法只用于测定浓度大于0.25μg/ml的核酸溶液。

(2)琼脂糖凝胶电泳法(荧光光度法):

对于很稀的核酸溶液,可以用琼脂糖凝胶电泳法。溴化乙锭在紫外光照射下能发射荧光,它插入到DNA分子中形成荧光结合物,使发射的荧光增强几十倍,而荧光的强度正比于DNA的含量,将已知浓度的标准样品作为电泳对照,就可以估计出待测样品的浓度。用量只需要5-10ng DNA即可,肉眼观察可检测0.05g-0.1g的DNA。该方法只是估计水平,另外还应考虑DNA或RNA样品中分子大小与标准对照中核酸分子的长度