监测蛋白质(检测蛋白质的试剂)

海潮机械 2023-01-21 06:06 编辑:admin 279阅读

1. 检测蛋白质的试剂

鉴别蛋白质,淀粉,肥皂溶液可以有2种常用方法. 1.用浓硝酸鉴别,分别取样,在样品中加入适量浓硝酸,变黄的是蛋白质溶液(黄蛋白反应),无明显变化的是淀粉,有固体析出的是肥皂水: C17H35COONa+HNO3----->C17H35COOH(固体)+NaNO3 2.先加碘水,变蓝的是淀粉. 将未变蓝的两种溶液中鼓吹入空气(或强振荡),有气泡产生的是肥皂溶液,无明显变化的是蛋白质溶液.

2. 蛋白质检测实验

双缩脲法

用于鉴定蛋白质的分析方法

双缩脲法是一个用于鉴定蛋白质的分析方法。双缩脲试剂是一个碱性的含铜试液,呈蓝色,由1%氢氧化钾、几滴1%硫酸铜和酒石酸钾钠配制。当底物中含有肽键时(多肽),试液中的铜与多肽配位,配合物呈紫色。可通过比色法分析浓度,在紫外可见光谱中的波长为540nm。鉴定反应的灵敏度为5-160mg/ml。鉴定反应蛋白质单位1-10mg。

基本信息

中文名

双缩脲法

外文名

Biuret method

成分

氢氧化钾、硫酸铜、酒石酸钾钠

名词解释

双缩脲反应产生的紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比,而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关,故可用来测定蛋白质含量。

双缩脲试剂中真正起作用的是硫酸铜,而氢氧化钾仅仅是为了提供碱性环境,因此它可被其他碱,如氢氧化钠所代替。向试剂中加入碘化钾,可延长试剂的使用寿命。

基本概况

实验原理

双缩脲(NH2CONHCONH2)是两个分子脲经180℃左右加热,放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中,双缩脲与二价铜离子形成紫色络合物,称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键,或能够以一个中间碳原子相连的肽键,这类化合物都有双缩脲反应。

紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比,而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关,故可用来测定蛋白质含量。干扰这一测定的物质主要有:硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。

此法的优点是较快速,不同的蛋白质产生颜色的深浅相近,以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差,不适合微量蛋白的测定。

试剂与器材

1. 试剂:

1.

1. 试剂:

(1)标准蛋白质溶液:用标准的结晶牛血清清蛋白(BSA)或标准酪蛋白,配制成10mg/ml的标准蛋白溶液,可用BSA浓度1mg/ml的A280为0.66来校正其纯度。如有需要,标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量,计算出其纯度,再根据其纯度,称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制,酪蛋白用0.05N NaOH配制。

(2)双缩脲试剂:称以1.50克硫酸铜(CuSO4·5H2O)和6.0克酒石酸钾钠(KNaC4H4O6·4H2O),用500毫升水溶解,在搅拌下加入300毫升10% NaOH溶液,用水稀释到1升,贮存于塑料瓶中(或内壁涂以石蜡的瓶中)。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现,则需要重新配制。

2. 器材:

1.

2. 器材:

可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。

操作方法

1.

标准曲线的测定:取12支试管分两组,分别加入0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0毫升的标准蛋白质溶液,用水补足到1毫升,然后加入4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后,在室温(20~25℃)下放置30分钟,于540nm处进行比色测定。用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。取两组测定的平均值,以蛋白质的含量为横坐标,光吸收值为纵坐标绘制标准曲线。

2、样品的测定:取2~3个试管,用上述同样的方法,测定未知样品的蛋白质浓度。注意样品浓度不要超过10mg/ml。

3. 蛋白质检测方法

1.双缩脲法是检测蛋白质的一个比较简单的方法。这种检测方法的灵敏度比较低一点,但是速度却比较快,一般用20到30分钟的时间就能够有效地检测出人体内蛋白质的含量了。不过通过双缩脲法只能够检测出蛋白质含量多少,并不能够清楚的判断出是哪种蛋白质。因为这种方法检测的时候不同蛋白质的显色程度是相似的,所以就很难辨别了。

2、酚试剂法

取6支试管分别标号,前5支试管分别加入不同浓度的标准蛋白溶液,最后一支试管加待测蛋白质溶液,不加标准蛋白溶液,在室温下放置30分钟,以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照,于650nm波长处测定各管中溶液的吸光度值。

3.硫酸铜法传统的用于检测人体蛋白质的方法,具体的检测过程如下。首先取0.2克的硫酸铜以及6克的硫酸钾,然后将适量的蛋白质用滤纸包裹好后,加入20ml的硫酸。然后在电炉子上进行融化,等到蛋白质中没有任何碳化颗粒,并且处于澄清状态下的时候在拿下来晾冷。再加入过氧化氢,直到把瓶中的蛋白质冲洗干净为止,再继续消化30分钟,就能够判断出人体的蛋白质了。

4. 蛋白检测方法

要检验还用到质量分数为0.1 g/mL氢氧化钠溶液(A)和质量分数为0.01 g/mL硫酸铜溶液(B)先将土豆研磨后加入水制成土豆组织样液,在其中加入A2ml,摇荡均后加入双缩脲试剂B1ml,摇荡均匀。如果组织里含有蛋白质,那么会看到溶液变成紫色。其实市场上卖的土豆有两种 一中有点透明,吃起来脆,另一中颜色深些,吃起来面些前者是转基因的,增加了土豆中的蛋白质含量,但不那么好吃后者是传统土豆,好吃些,但是没多少蛋白质,营养不高

5. 蛋白质测定的方法

1. isothermal titration calorimetry (ITC),直接测定两个蛋白互相作用的Kd值。

2. AUC,也就是超速离心分析。可以直接测定两个蛋白相互作用与否。

3.SAXS, 也就是X-ray小角散乱。不过技术难度比较大一些。

4. 溶液NMR,这个应该可以但不太了解。

5. 结晶再解构,这个不用解释了。比较究极一点。

6.cryo-EM,同上。比较究级的方法。

7. 最简单常用的,gel-filtration,观察有没有oligomer的分子量峰出现。但是相互作用弱的话很难观测到。

8.更简单常用的nativePAGE,同上,相互作用弱则很难观测到。

9.用氨基架桥试剂共价连接,然后SDS-PAGE。看看有没有oligomer的带。暂时想到这些,跨度比较大。

6. 怎样检测蛋白质

A、只有脂肪的鉴定需要使用显微镜,用来观察细胞内的脂肪颗粒,A正确;

B、用双缩脲试剂检测蛋白质不需要加热,要注意使用方法,先加A液再加B液,B正确;

C、可溶性还原糖的鉴定,应用水浴加热产生砖红色沉淀,C错误;

D、使用斐林试剂要现配现用,甲乙液等量混均使用,D正确.

故选:C.