1. 吸光度测蛋白质含量
双缩脲法
用于鉴定蛋白质的分析方法
双缩脲法是一个用于鉴定蛋白质的分析方法。双缩脲试剂是一个碱性的含铜试液，呈蓝色，由1%氢氧化钾、几滴1%硫酸铜和酒石酸钾钠配制。当底物中含有肽键时（多肽），试液中的铜与多肽配位，配合物呈紫色。可通过比色法分析浓度，在紫外可见光谱中的波长为540nm。鉴定反应的灵敏度为5-160mg/ml。鉴定反应蛋白质单位1-10mg。
基本信息
中文名
双缩脲法
外文名
Biuret method
成分
氢氧化钾、硫酸铜、酒石酸钾钠
名词解释
双缩脲反应产生的紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。
双缩脲试剂中真正起作用的是硫酸铜，而氢氧化钾仅仅是为了提供碱性环境，因此它可被其他碱，如氢氧化钠所代替。向试剂中加入碘化钾，可延长试剂的使用寿命。
基本概况
实验原理
双缩脲（NH2CONHCONH2）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与二价铜离子形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能够以一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。
紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。
此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差，不适合微量蛋白的测定。
试剂与器材
1. 试剂：
1.
1. 试剂：
（1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml的标准蛋白溶液，可用BSA浓度1mg/ml的A280为0.66来校正其纯度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0．05N NaOH配制。
（2）双缩脲试剂：称以1.50克硫酸铜（CuSO4·5H2O）和6.0克酒石酸钾钠（KNaC4H4O6·4H2O），用500毫升水溶解，在搅拌下加入300毫升10% NaOH溶液，用水稀释到1升，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。
2. 器材：
1.
2. 器材：
可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。
操作方法
1.
标准曲线的测定：取12支试管分两组，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后，在室温（20~25℃）下放置30分钟，于540nm处进行比色测定。用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。取两组测定的平均值，以蛋白质的含量为横坐标，光吸收值为纵坐标绘制标准曲线。
2、样品的测定：取2~3个试管，用上述同样的方法，测定未知样品的蛋白质浓度。注意样品浓度不要超过10mg/ml。
2. 蛋白质的最大吸光度
荧光物质的量子效率定义为出射荧光光子数和入射光光子数的比. 这个量用来测量蛋白质的吸光度,由于不同的蛋白质有不同的一级结构,二级结构,三级结构和四级结构,它们的荧光量子效率,也就是单位入射荧光的吸收值是不同的,这个数值可以用来检验蛋白质.
3. 吸光度测蛋白质含量的仪器
1、直接将带条带的凝胶放在凝胶呈像系统中进行定量分析。
2、将所需要的条带剪切下来,用X体积蒸馏水溶解，通过紫外分光光度计在280纳米条件下，测定吸光度值。根据仪器目前标准曲线计算蛋白质浓度，与蒸馏水体积相乘，得到蛋白质质量。
3、如果样品中含有荧光成分，可以进行荧光分析。
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4. 吸光度测蛋白质含量准吗
OD260/280比值指260nm和280nm下吸光光度比值。OD是optical density（光密度）的缩写，表示被检测物吸收掉的光密度， OD=lg（1/trans），其中trans为检测物的透光值。
一般来说OD260代表核酸的吸光度，OD280代表蛋白质的吸光度。 A260/A280与OD260/OD280的意思是一样的。A代表吸光值，而OD是光密度值，一个意思。
5. 吸光度测蛋白质含量中清洗玻璃器皿应注意哪些
含有芳香侧链的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸）具有强烈的紫外吸收能力。因此，蛋白与肽的浓度和其芳香族氨基酸含量与紫外吸光度是成比例的。一旦确定了给定蛋白的吸光度（氨基酸已确定），其蛋白浓度可以通过吸光度来确定。
紫外吸收法用于蛋白浓度检测时，最低浓度可达0.1mg/mL，但是对于成分复杂的蛋白溶液（比如细胞裂解物），用紫外吸收就很难估计它们的浓度，因为溶液中组成复杂，具有吸光系数不同的蛋白，除此之外溶液中的核酸也会影响结果。然而，对于绝大多数实验室条件下，用于科研的水溶性蛋白，测量其在280nm吸光度即可最大限度减少其他化合物的干扰。
蛋白和肽在280nm吸光度主要受色氨酸、酪氨酸和半胱氨酸的影响，上文提到的苯丙氨酸只在较低波长（240-265nm）下吸收。